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細菌塗抹標本の特徴と調製
の 細菌塗抹標本 光学顕微鏡下での観察のために、透明なガラスプレートまたはスライド上で行われる細菌性微生物の懸濁液の薄膜の形態の延長である。.
フィルムの形での拡張は、微生物をできる限り分離するために行われる。なぜなら、それらがグループ化されていると、観察結果は明らかではないからである。.
塗抹標本作製の細菌培養技術の研究において、固定および着色はそれらをより良く分析するために使用される。微生物の大きさが小さいため、その観察には必然的に光学顕微鏡の使用が必要です。.
光学顕微鏡は、塗抹標本の観察に不可欠な機器です。これらは光学レンズと光を使用しており、サイズを大幅に拡大してサンプルを視覚化する.
一般に、生細胞はほとんど着色された構造を持っていません。光学顕微鏡を通して見ると、それらは無色透明なサンプルです。.
補助的な染色技術を使用せずに、単純なライトフィールド顕微鏡による観察は非常に限られており、微生物の移動の観察におけるように、場合によってのみ使用される。.
微生物を最適に観察するためには、コントラストと解像度のバランスをとる必要があります。細胞の細部は、たとえ高解像度であっても顕微鏡下で観察することはできません。染色のための染料の使用が必要.
索引
- 1良質バクテリア塗抹標本の特徴
- 1.1優れたコントラスト
- 1.2良い修正
- 1.3良い染色
- 2準備
- 2.1 A.フロティス
- 2.2 B.固定
- 2.3 C.単純染色
- 2.4 D.塗抹標本の最終的な保存
- 3参考文献
良質の細菌塗抹標本の特徴
優れたコントラスト
優れたコントラストを達成するために、と呼ばれる洗練された顕微鏡があります 位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡および暗視野顕微鏡. このタイプの顕微鏡は、とりわけ鞘やフィラメントなどの細菌構造を観察するために使用されます。.
染色は、明視野顕微鏡で達成されるコントラストを高めるための簡単な技術です。この技術では、顕微鏡下での観察を著しく改善する様々な染料を使用することができる。.
汚れはスライド上の微生物の懸濁液の塗抹標本または延長部分に直接作られ、以前に乾燥されそして固定されている。.
良い修正
固定は細胞構造を保存するために使用される技術です。微生物の不活化とスライドガラスへの付着を引き起こします。異なる固定処理があります：熱固定と化学固定.
熱固定
これは細菌塗抹標本の観察に最もよく使われる方法です。この技法は、塗抹標本のバクテリア懸濁液をライターの炎で通過させることからなります。この技術はバクテリアの外部形態を保存することができますが、それらの内部構造を破壊します.
化学固定
化学固定は、とりわけホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド、エタノールおよび酢酸などの保存に化学物質を使用する。化学固定剤を使用する利点は、微生物の内部細胞構造の保存が達成されることである。.
良い染色
以前に乾燥し固定した塗抹標本を染色するための最も一般的な手順は、ポジティブ染色または単純染色、ディファレンシャル染色およびネガティブ染色である。特定の細胞構造（カプセル、胞子、べん毛）を染色するための特別なテクニックもあります。.
ポジティブ染色または単純染色
ポジティブ染色または単純染色は、最もよく使用される染色塗抹技術です。顕微鏡下でそれらを観察することを可能にする、特定の微生物構造に結合する能力を持つ染料を使用します.
これらの染料は、化学構造中に発色団（着色部分）を持ち、交互の二重結合と単純な結合（共役）を持っています。これらの結合は次にいくつかの細胞構造とイオン性または共有結合を確立することができる。.
ポジティブ染色または単純染色に使用される染料は、主に アニリン （着色有機塩）.
一方、染料の中には塩基性pHのものと酸性pHのものがあります。.
基本着色剤
塩基性染料において、発色団基は正電荷を有する。大部分の原核微生物は中性の内部ｐＨを有し、それらの細胞表面は負に帯電している。この静電相互作用を通して、発色団は細胞に結合してそれを染色します。.
塩基性染料の例は、とりわけ、メチレンブルー、バイオレットクリスタル、マラカイトグリーン、塩基性フシン、サフラニンである。.
酸性染料
酸性染料では、発色団は負電荷を有する。これらは、正電荷を帯びたアミノ基でタンパク質を染色するために使用されます。酸性染料の例は、酸性フスシン、ローズベンガル、コンゴーレッドおよびエオシンである。.
ディファレンシャル染色
示差染色の技術は、顕微鏡下で異なる微生物を区別するために、異なる色または強度の2つの染料を適用することからなる。グラム染色および酸アルコール耐性染色は、細菌学において最もよく使用されている識別染色です。.
グラム染色は、細胞壁の種類に加えて、形状、大きさ、細胞の分類を知るための予備的な検査として使用されます。グラム染色試験により、細胞壁を持つ細菌はグラム陽性菌とグラム陰性菌に分類されます。.
ネガティブ染色
この技術では、細胞の内部に浸透しない化学染料が使用されていますが、微生物が含まれている媒体は黒い背景として表示されています。.
ネガティブ染色の技術では、塗抹標本は、室温で乾燥させた後に光の通過に対して不透明なフィルムを形成する、１滴の墨またはニグロシンの懸濁液の滴で作られる。このように、微生物は暗い背景上に明るい形として観察されます。.
準備
A.スミア
1.-スライドをよく洗い、吸収紙で乾かしてからラベルを貼ります。ラベルは、準備の内容、それを処理した人の日付と名前を示さなければなりません.
2.-ライターを点灯させ、炎が熱くなるまで接種ループを消毒する.
3.-ハンドルを冷まします.
4.-細菌培養液のチューブを取り、キャップを外してライターの炎の近くにあるチューブの口を素早く通過させます（炎）。.
5.-細菌培養液を含むチューブの中に接種ループを導入し、サンプルを採取する.
6.-培養液が液体培地の場合は、取っ手で取ったサンプルをスライドの中央に置き、直径約2 cmの円に慎重に広げる.
7.-接種ループを再滅菌する.
8.-空気中の汚れを乾燥させる.
9.-手順3〜8を3回繰り返す.
10.-培養液が固体培地の場合は、あらかじめスライドに蒸留水を1滴入れます。これは、ステップ2から5の指示（無菌状態）に従って、接種のハンドルを使って採取した培養液の少量のサンプルを混合するために行われます。.
11.-スライド上の水滴で希釈したサンプルを広げ、3回繰り返す.
B.固定
1.-乾いた塗抹標本に、液体培地で培養したもの、2滴のメタノールまたは無水エタノールを加える。.
2.-ライターから離れた空気中で乾燥させる.
3.-塗抹標本が固形培地の培養液に由来する場合、乾燥塗抹標本は熱で固定されており、軽い火炎の最も熱い部分を素早く2〜3回通過させます。.
4.-塗抹標本の下部を左手の背面部に触れ（右利きの場合は右利き用）、寒さがないことを確認します。.
C.簡単な染色
1.-塗抹標本に選択した染料の2滴を追加し、それが各染料の特定のプロトコルで必要な時間（通常1〜5分）の間作用させる.
2.-いくつかの染料は活性化のために熱の使用を必要とします、その場合それはライターの炎の中でスライドを加熱するとき非常に慎重であることが必要です（ピンセットでそれを操作し沸騰を避けます）。塗抹標本の過熱はあなたが観察したい細胞を破壊することができます.
3.-ピケットから蒸留水で洗って、余分な染料を取り除きます。スライドの端をスライドさせて、作業台の上に傾けて洗浄水を取り除きます。.
4.-風乾させる.
5.-観察の種類に応じて、カバーガラスがこの段階で使用されるかどうかが決まります。カバーガラスは塗抹標本を保護し、保存します。この段階で油に浸して観察した場合、カバーガラスは使用されませんが塗抹標本は保存できません.
D.塗抹標本の最終的な保存
1.-下記の各溶液に、最低5分間、塗抹標本を連続的に浸します。これらの「風呂」の目的は、塗抹標本を完全に脱水状態にすることです。次の浴槽に塗抹標本を導入する前に、各試薬を排出する必要があります.
脱水浴の順序は以下の通りである。
- エタノール70％
- 95％エタノール
- 純アセトン
- アセトン - キシロールを1：1で混合する
- キシロール
その後風乾させる.
2. - カナダのバルサムまたは他の組み立て手段を使用して、カバーガラスを取り付けます（できれば22×22 mm）。.
参考文献
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