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DNAシークエンシングMaxam-Gilbert、Sanger法、例
の DNAシーケンス （デオキシリボ核酸）は、関心のある遺伝物質中のヌクレオチドの順序を知ることを可能にする分子生物学実験室で行われる手順である。さらに、ＲＮＡ（リボ核酸）の配列決定もまた明らかにされ得る。.
この技術は生物科学の発展に欠かせないものです。医療診断や法医学的調査など、他の知識分野にも適用できます。.
以前は、ＤＮＡ鎖の配列決定は遅くて高価な活性と考えられていたので、オリゴヌクレオチド中のわずか数塩基対の同定しかできなかった。.
今日、科学のすべての進歩に伴い、この分野における50年近くの研究の貢献のおかげで、DNAシーケンシングは世界中の多くの研究室で日常的に行われています。鎖の長さに関しては、非常に短時間で最大数百万の塩基対を配列決定することができます。.
そうするために、価格と正確さにおいて異なるたくさんの技術が開発されています。この記事では、古典的手法と現代的手法の両方について、それぞれ長所と短所を含めて説明します。.
これまでのところ、配列決定技術は、小さな原核生物および酵母からヒトゲノムまで、完全なゲノムの配列を得ることを可能にする。.
索引
- 1 DNAの構造
- 2歴史
- 3サンガー法
- 3.1反応の主成分
- 3.2結果を読む
- 4自動シーケンス
- 5マキサム - ギルバートシーケンス
- 5.1手続き
- 5.2結果を読む
- 6大規模シーケンス
- 6.1パイロシーケンシング
- 6.2合成による配列決定
- 6.3連結による配列決定
- 6.4シーケンスイオントレント
- 7例
- 7.1ヒトゲノムの配列決定
- 8重要性とアプリケーション
- 9参考文献
DNAの構造
ＤＮＡ配列決定に使用される方法および技術を理解するためには、分子の構造および組成の特定の重要な側面を知ることが必要である。.
DNAは、バクテリアから大型の水生動物まで、あらゆる生物に見られる生体分子です。細胞小器官 - ミトコンドリアや葉緑体のように - はそれらの中に環状のDNA分子を持っています。いくつかのウイルスでも、見つかった遺伝物質はDNAです。.
構造的には、DNAは一連のヌクレオチドです。それぞれは炭水化物、窒素含有塩基（A、T、CまたはG）とリン酸基によって統合されています。 ＤＮＡ配列決定の目的は、４つの窒素含有塩基が配列中に見出される順序を明らかにすることである。.
歴史
1950年代半ばに、研究者ワトソンとクリックは、キリスト教の技術を使ってDNAの構造を記述しました。しかしながら、これらの研究者の誰もが、配列を発見する方法を見つけることができませんでした.
前任者はいましたが、最も重要な出来事は1977年のサンガー法の創設でした。この方法の父であるフレデリック・サンガーは、英国の生化学者で、ノーベル賞を受賞し、生物科学に多大な貢献を果たしました。.
この技術はまた、文献において「連鎖停止」またはジデオキシヌクレオチドとして知られている。次に、この手法の原理と、この手法の改善と革新に基づいて開発された手法について説明します。.
サンガー法
サンガー法の開発は分子生物学における重要な出来事を表していました。それは通常細胞で起こるDNA複製過程の基本的な構成要素を含みますが、特別な構成要素を加えることによって：ジデオキシヌクレオチド.
反応の主成分
- DNAポリメラーゼ：酵素DNAポリメラーゼはプロセスの重要な要素です。この分子はDNA鎖の複製に関与しており、その役割は新しい鎖の合成であり、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と相補鎖とを一致させる.
DNAでは、チミン（T）は2つの水素結合によってアデニン（A）と対になっていますが、シトシン（C）はグアニン（G）と3つの橋によってつながっています。.
- ヌクレオチド：サンガーシークエンシングは、２種類のヌクレオチド、４つの２'－デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰと略される）および４つのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰ）を含む。.
ジデオキシヌクレオチドは、通常ＤＮＡに組み込まれるモノマーと類似しているが、それらはそれらの構造中に−ＯＨ基を欠いている。これは鎖に新しいヌクレオチドを追加することを不可能にする.
したがって、特別なヌクレオチドが完全にランダムな方法で形成中の鎖に付加されると、合成は麻痺する。このようにして、反応の終わりに、異なるサイズの鎖があり、それぞれが反応が異なる点で停止したところである。.
実験的に、4つの試験が準備されています。それぞれが、目的の生物学的サンプルから抽出されたDNA、正常なヌクレオチド、および4種類の特殊ヌクレオチドのうちの1つを含みます。あるいは、特殊なヌクレオチドはある種の蛍光マーカーでマークされています（下記の自動シークエンシング参照）。.
結果の読み方
最初のステップは、それぞれの合成された鎖をそれらのサイズに従って分離することです。特別な基地が組み込まれた場所によっては、他のものよりも長いものもあります。.
識別特性としてサイズを用いて混合物の成分の分離を可能にする異なる生化学的技術がある。サンガー法では、異なる鎖が電気泳動によって分離される。技術の最も洗練された変形において、キャピラリー電気泳動が使用される。.
従って、より長いストランドはより短い変異体よりも移動が少ない。次に、このシステムは各ジデオキシヌクレオチドに含まれるマーカーを認識するリーダーを通過する。このようにして、シーケンスの順序を知ることができます。.
この「第一世代」技術は、１キロベース以下のＤＮＡ断片を読むことができる。現在、サンガーの方法はいくつかの実験室で、一般にその現代の変法で使用されている。さらに、最も複雑な手法で得られた結果を裏付けるために使用されていますが、精度は低下しています。.
自動シーケンス
大規模な配列決定が必要な場合は、自動化によってプロセスが加速されます。これは、それらを区別するためにプライマーが蛍光生成物で標識されているサンガー連鎖停止法の変形である。.
続いて、反応の生成物を電気泳動にかける - 全て単一レーンに入れる。各断片がゲルの最後の部分を離れると、1％を囲むエラーでその蛍光ラベルによってすばやく識別されます。.
最も洗練されたシステムは、ロボットに接続されたコンピュータによって操作される最大９６本の毛細管のシステムを有する。すなわち、９６個のＤＮＡサンプルを同時に評価することができる。したがって、電気泳動および結果の分析を含むプロセスは完全に自動化されています.
1日で、これらのシステムは最大55万塩基まで配列することができます。プロセスの間、人間の作業は不要です、それは方法を開始するために約15分かかります.
Maxam-Gilbertによる配列決定
Sangerが自身の研究を発表したのと同時に、Allan MaxanとWalter Gilbertという2人の研究者がDNA配列を得るための別の方法を開発することに成功した。当時、この方法は人気を博していましたが、後にSangerの方法の改良によって置き換えられました。.
サンガーの方法とは反対に、マキサンおよびギルバートの配列決定（またはそれも知られているように化学的配列決定）はハイブリダイゼーション反応を含まない。この方法論は、一端に反応剤を用いてマーキングし、続いて精製工程を行うことからなる。.
この技術のマイナス面の1つは、その非常に複雑な点と、ユーザーにとって危険な化学物質の使用にあります。化学的分解は、塩、DMS、ギ酸、ヒドラジンおよびヒドラジンの適用によって引き起こされる.
手続き
このプロトコールは、鎖の５ '末端を蛍光体マーカー３２で標識することから始まり、次いで窒素含有塩基の化学修飾が起こり、それは分離される。最後に無塩基領域の分裂が起こります.
最初に、配列決定される鎖がより小さなセグメントに短縮される。この工程は制限酵素を用いて行われ、それは顕著な極値をもたらす。.
次に、リン酸基を除去することを目的とするアルカリホスファターゼを用いて反応を実施する。したがって、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識を行うことができる。.
鎖は変性している（２本鎖が開いている）。それから私達は化学薬品を適用し続けます。これらの開裂反応は制御された方法で行われ、どの種類の結合が適用された各化学物質によって破壊されます。.
結果の読み方
サンガー法と同様に、結果の読み取りは電気泳動システムで得られた鎖のサイズによる分離を含む。ポリアクリルアミドからなるシステムは、ゲルを読むための非常に適切な解像度を得ることを可能にする。.
大規模シーケンス
大量シークエンシングは、NGSと略される、英語の一連の新しい方法を網羅しています。次世代シーケンシング」.
ＮＧＳとしてカタログ化された方法は、ＤＮＡ増幅の前のステップを必要とする（それらは単一分子ではうまくいかない）。さらに、使用されるプラットフォームは大きく異なります。最も一般的な方法の原理を以下に説明します。
パイロシーケンシング
それはピロリン酸の放出をモニターすることを含み、それは新しいヌクレオチドがＤＮＡ鎖に付加されるたびに起こる。酵素システムが結合されているため、新しいヌクレオチドが取り込まれるたびに発光（カメラで検出可能）が発生します。.
このプロセスは、発光があるかどうかを確認するために各窒素含有塩基を別々にインキュベートすることから始まります。パイロシーケンシングは長い鎖の読み取りを実行することができるが、発見されたエラー率は高い.
合成による配列決定
これは標識ヌクレオチドの取り込みを含む。これらの蛍光成分を添加し、洗浄し、そして取り込まれたヌクレオチドを記録する。その後、ヌクレオチド標識は排除され、鎖の合成は継続することができる。次の工程において、標識ヌクレオチドもまた組み込まれ、そして言及された工程が繰り返される。.
この技術の１つの欠点は、蛍光マーカーが完全に排除されていないときに生じる。これらの排出量はバックグラウンドエラーを引き起こし、重大なエラーを引き起こします.
ライゲーションによる配列決定
それはＤＮＡポリメラーゼを使用しないので、この技術は他のものとは異なる。代わりに、この方法論の重要な酵素はリガーゼです。これは蛍光標識されたDNA断片で、酵素に結合されて検出されます。.
この手法の最大の問題は、処理可能な非常に短い長さのフラグメントです。.
イオンシーケンストレント
この技術はHイオンの測定に基づいています+ これは新しいヌクレオチドが取り込まれるたびに放出される。原理はパイロシーケンシングと非常に似ていますが、はるかに安価です。.
例
ヒトゲノムの配列決定
ヒトのゲノムのシークエンシングは、生物学における最も有望な課題の1つであり、また科学の歴史において最も高い評価を得ている対立の1つでもあります。実際、このプロジェクトに携わっている科学者にとって、ゲノムの配列決定は競争になりました.
1990年に彼はノーベル賞を受賞した有名な科学者、ジェームズワトソンが率いる「ヒトゲノムプロジェクト」と呼ばれるものを始めました。 1年後の1991年、ヴェンターはワトソンを「殴打」してゲノムをシークエンスするという挑戦を始めました。しかし、1992年に、ワトソンは引退し、命令は他の研究者によって取られました.
1995年に、Venterはランダムシークエンシング法による細菌ゲノムの完全シークエンシングに成功したことを発表しました。同様に、反対側のチームは1年後に酵母ゲノムの配列決定を発表しました.
2000年にレースは終了しました。両社は、科学分野で最も権威のある2つのジャーナルで、完全なゲノムの予備的な結果を発表しました。 自然 そして 科学.
しかし、科学者たちは提案の改善に取り組み続け、2006年にはシーケンスは特定のヒト染色体で完成しました。.
重要性とアプリケーション
DNAと同じくらい重要な分子のヌクレオチドの順序を知ることは、生物学者や関連する専門家にとって価値があります。このポリヌクレオチド鎖には、すべての生命体の開発と維持に必要なすべての情報が含まれています.
これらの理由のために、この配列の知識は生物学的研究にとって不可欠である。基本的に、配列決定により、生物学的システムの最も重要な特性の1つを測定し、それらの間の違いを明らかにすることができます。.
ある種のDNA配列は、2つの生物が同じ種に属するかどうかを判断する基準を確立し、それらの間の系統学的関係についての仮説を提案することができるので、配列決定は分類学者および体系学者によって広く使用されている。.
さらに、ＤＮＡ配列決定は医学および診断学の分野において用途を有する。例えば、配列決定を通じて、いわゆる単純ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を用いて特定の疾患（癌など）を発症する傾向を評価することを可能にする、手頃な価格で入手可能なシステムがある。.
犯罪主義的および法医学的タイプの調査もまた、シークエンシングの技法で強化されており、犯罪への特定の個人の参加の信頼できる証拠として使用することができます。.
参考文献
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