ギムザ染色の基礎、材料、技法および用途



の ギムザステイン 酸性染料と塩基性染料の混合物に基づく、臨床サンプルの染色の一種です。その創設はRomanowskyによってなされた作品にインスパイアされました。そこではドイツ出身の化学者であり細菌学者でもあるGustav Giemsaは、化合物を安定させるためにグリセロールを加えることによってそれを完成させました。.

Romanowskyのオリジナルのテクニックに加えられた変更は顕微鏡観察をかなり改善することを可能にしました、それ故にテクニックはギムザステインの名前で洗礼を受けました.

それは実行するのが簡単な技術であり、非常に機能的でそして経済的であるので、それは血液学的塗抹標本、骨髄サンプルおよび組織切片のために臨床検査室で現在広く使用されている。.

ギムザ染色法は、細胞の特定の構造の観察を可能にするので、細胞学的研究にとって非常に有用である。この技術は、細胞の細胞質、核、核小体、液胞および顆粒を染色し、微細な微量のクロマチンでも区別することができます。.

さらに、核の大きさ、形状または着色の有意な変化を検出することができ、そこで核 - 細胞質関係の喪失を視覚化することが可能である。.

その一方で、骨髄や末梢血中の未熟細胞を特定することができ、白血病などの重篤な疾患の診断に重要です。とりわけ、寄生虫、細胞外および細胞内細菌、真菌を検出することも可能である。.

細胞遺伝学では、細胞の有糸分裂を研究することが可能であるので、それはかなり使われます。.

索引

  • 1ギムザカラーリングの基礎
  • 2材料
    • 2.1母液を調製するための材料
    • 2.2母液の調製モード
    • 2.3緩衝液を調製するための材料
    • 2.4染料の最終調製
    • 2.5着色に必要な追加の材料
  • 3テクニック
    • 3.1染色プロセス
  • 4ユーティリティ
    • 4.1血液学
    • 4.2菌学
    • 4.3細菌学
    • 4.4寄生虫学
    • 4.5細胞診
    • 4.6細胞遺伝学
  • 5ギムザ染色の有効性を実証する研究
  • 6良い染色のための推奨事項
  • ギムザの着色における7つの一般的な誤り
    • 7.1非常に青い着色
    • 7.2過度にピンク色
    • 7.3塗抹標本に沈殿物がある
    • 7.4形態的アーティファクトの存在
  • 8収納モード
  • 9参考文献

ギムザカラーリングの基礎

Romanowskyタイプの染料は、それぞれ塩基性および酸性構造の染色を達成するために、酸性染料と塩基性染料との間のコントラストの使用に基づいている。見て分かるように、基本構造を染色する酸性染料の親和性があり、逆もまた同様である。.

使用される塩基性染料はメチレンブルーとその酸化誘導体（Azure AとAzure B）で、酸性染料はエオシンです。.

細胞の酸構造は核酸、セグメント化された好塩基球の顆粒などであり、したがってメチレンブルーで染色されます。.

これと同じ意味で、細胞の基本構造は、ヘモグロビンおよびいくつかの顆粒、例えばセグメント化好酸球に含まれるものなどである。これらはエオシンで染色されます.

他方、メチレンブルーおよびアズールは変色性染料によって特徴付けられるという事実のために、それらはそれらが有するポリアニオンの負荷に従って異なる構造に可変の色調を与えることができる。.

これは、塩基性染料と酸性染料の戦略的な組み合わせが、各構造の生化学的特性に従って、酸性構造の場合には淡い青、濃い青、薄紫色、紫の色調を経て、広範囲の色を発色させる方法です。.

エオシンによって提供される着色がより安定している間、赤みがかったオレンジとサーモンの間に色を生成する.

材料

母液を調製するための材料

原液の調製には、アセトンを含まないメチルアルコール500 ccと中性グリセリン50 ccを計る、600 mgの粉末ギムザ染料が必要です。.

母液の調製モード

重いギムザパウダーを乳鉢に入れます。しこりがある場合は、それらをスプレーする必要があります。続いて、かなりの量の測定されたグリセリンを加えてよく混ぜる。得られた混合物を非常にきれいな琥珀色の瓶に注ぐ。.

グリセリンの残りの部分はモルタルに入れます。モルタルの壁に付着している残りの染料をきれいにするために再び混ぜ合わせて、同じ瓶に注ぎます.

ボトルにふたをして55℃のウォーターバスで2時間運びます。ベインマリーバスに入っている間、30分かそこら毎に混合物を軽くかき混ぜる.

その後、混合物を冷却してアルコールを入れる。以前は、測定されたアルコールの一部を乳鉢に入れて染料の残りを洗い終えた後、残りのアルコールと共に混合物に加えていました。.

この製剤は少なくとも2週間は熟成させるべきです。母液の使用部分は濾過しなければならない。.

製剤の汚染を避けるために、常時使用する部分をスポイト付きの小さな琥珀色の瓶に入れることをお勧めします。試薬がなくなるたびに充電してください.

緩衝液を調製するための材料

一方、ｐＨ７．２の緩衝液を以下のように調製する。

６．７７グラムのリン酸ナトリウム（無水）を秤量する（ＮａＨＰＯ）。4）、２．５９ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ）2PO4）および1000 ccまでの蒸留水.

染料の最終調製

最終染色液の調製のために、２ｃｃの濾過した原液を秤量し、そして６ｃｃの緩衝液と混合する。混合物を撹拌する.

考慮に入れなければならない関連する事実は、染料の調製の技術は商業家に従って変わることができるということです。.

着色を行うために必要な追加の材料

記載された材料とは別に、それはカラーブリッジ、水スクリーンまたは洗濯用緩衝液、物体またはカバーのためのシート、着色時間および吸い取り紙を制御するためのストップウォッチまたは乾燥に使用できる何らかの材料を備えるべきである。ガーゼまたは綿）.

テクニック

染色プロセス

1）着色する前に、サンプルをきれいなスライドに広げておく必要があります。.

試料は、血液、骨髄、組織学的組織の切片または頸膣サンプルであり得る。それはそれらを着色する前に外側が薄くて、乾燥の1または2時間を持っていることをお勧めします.

2）あなたが着色しなければならないすべてのシートは、着色された橋の上に置かれます。常に同じ順序で作業し、各シートをよく識別してください.

３）塗抹標本の上に数滴の１００％メチルアルコール（メタノール）を置き、そして試料を固定しそして脱水するために３〜５分間放置する。.

４）シート中に存在するメタノールを捨て、風乾させる。.

5）乾いたら、シート全体が覆われるまでスポイトで最終染色液を置きます。 15分間そのままにします。何人かの著者は25分までに推薦する。商業住宅による.

6）染料を抜き取り、塗抹標本を蒸留水または7.2緩衝液で洗浄する.

７）吸い取り紙の上に、支持体の助けを借りて垂直に配置されたシートを屋外で乾燥させる。.

8）アルコールで湿らせたガーゼまたは綿棒でスライドの裏側を拭き、残っている染料をすべて取り除きます。.

公益事業

ギムザ染色法は、血液学、真菌学、細菌学、寄生虫学、細胞学および細胞遺伝学を含むいくつかの分野で使用されています。.

血液学

それはこの染色に与えられる最も頻繁な実用性です。それを用いて、骨髄または末梢血のサンプルに存在するすべての細胞を識別することができます。白血球増加症または白血球減少症、血小板減少症などを検出することができること、各シリーズの数を推定することと同様に.

未熟細胞を特定することは敏感であるので、それは急性または慢性白血病の診断に関連している。とりわけ、鎌状赤血球症、鎌状赤血球症などの貧血を診断することも可能である。.

菌学

この分野では、検索にそれを使用するのが一般的です。 Histoplasma capsulatum 組織サンプル中の（細胞内二形性真菌）.

細菌学

ギムザ染色した血液塗抹標本では、検出することが可能です。 ボレリアスsp 再発熱と呼ばれる病気を患っている患者に。スピロヘータは、発熱ピークで採取したサンプル中の赤血球に豊富に含まれています.

細胞内細菌を次のように可視化することも可能です。 リケッチアsp そして クラミジアトラコマチス 感染細胞.

寄生虫学

寄生虫学の分野では、ギムザ染色はマラリア、シャーガス病およびリーシュマニア症などの寄生虫症の診断を可能にした。.

最初の2つの寄生虫 プラスモジウムsp そして Trypanosoma cruzi それぞれそれらは感染した患者の末梢血で視覚化することができます、彼らは病気がある段階に応じてさまざまな段階で見つけることができます。.

血液寄生虫の検索を改善するために、May-Grünwald染料と混合したGiemsa染色を使用することが推奨されます。.

同様に、寄生虫が発見されるギムザ染色された皮膚生検のサンプルを評価するときに、皮膚リーシュマニア症が診断されることがあります。.

細胞診

ギムザ染色は、子宮頸管内サンプルの細胞学的検査にも使用されますが、この目的のために最も頻繁に使用される技術ではありません。.

しかし、リソースが不足している場合は、Papanicolaouの手法で提供される機能と同様の機能を低コストで使用できます。ただし、審査官側の専門知識が必要です.

細胞遺伝学

ギムザ染色の関連する特徴は、ＤＮＡアデニンおよびチミンに富む領域に強く結合するその能力である。これにより、細胞の有糸分裂の間に、さまざまな凝縮状態でDNAを視覚化することができます。.

これらの研究は、染色体の異なる領域の重複、欠失または転座などの色収差を検出するために必要である。.

ギムザ染色の有効性を実証する研究

Cannova et al（2016）、皮膚リーシュマニア症の診断のための3つの着色技術の比較.

このために、彼らは実験動物から得たサンプルを使いました。Mesocrisetus auratus） 実験的にLeishmaniasを接種した.

著者らは、ギムザ染色がPap-mart®およびGaffney染色よりも優れていることを実証した。したがって、彼らはギムザ染色が皮膚リーシュマニア症の診断に理想的であると考えました。.

筆者らによって得られた優れた結果は、ギムザ混合物を構成する染料の組み合わせが好ましいコントラストを作り出すために必要な条件を提示し、アマソチゴート構造を細胞内と細胞外の両方で明確に区別することを可能にするという事実による。.

他のテクニック（Pap-mart®とGaffney）もそれを行いましたが、弱い方法であり、したがって視覚化するのがより困難です。ギムザ染色がリーシュマニア症の寄生虫診断に推奨されるのはそのためです。.

同様に、Ramírezet al（1994）による研究では、以下を同定するために、結膜塗抹標本におけるギムザおよびレンドラム染色の有効性が評価されている。 クラミジアトラコマチス.

Giemsa染色とLedrum染色は同じ特異性を有すると著者らは判断したが、Giemsaはより高感度であった。.

これは、なぜ現在ギムザ染色がクラミジア感染症の診断に最も頻繁に使用されているのかを説明します、特にリソースが少ない場合.

良い染色のための推奨事項

シートの乾燥は加速されるべきではありません。慎重な時間は、屋外で乾燥させるのを待たなければなりません。約2時間.

最良の結果を得るために2時間後にすぐに色を付ける.

塗抹標本をよりよく固定し染色するためには、薄く均一な層が残るようにサンプルをシート上に分配しなければならない。.

塗抹標本は血液滴から直接作られ、それ故にサンプルには添加物がなく、細胞構造の維持に有利であるので、好ましい血液サンプルは毛細管である。.

しかしながら、静脈血が使用される場合、後者は通常細胞を変形させるので、EDTAはヘパリンではなく抗凝固剤として使用されるべきです。.

ギムザの着色における一般的な間違い

この着色の練習では、間違いを犯すことができます。それらは構造の色合いの突然の変化によって証明されます.

非常に青い着色

それが原因である可能性があります。

  • 非常に濃い塗抹標本
  • 染色時間を超過
  • 洗濯が少なすぎる.
  • 中性pH（アルカリ性）をはるかに超える試薬の使用.

これらの条件下では、次の構造の色が歪んでいるので、死にかけているピンクサーモンの代わりに赤血球は緑色に見え、赤レンガに染めるべき好酸球の顆粒は青または灰色に変わるでしょう。通常の色調のずれ.

過度にピンク色

それが原因である可能性があります。

  • 染色時間が足りない.
  • 長時間または過度の洗浄.
  • 乾燥不良.
  • 強酸性試薬の使用.

この特定のケースでは、通常青色に染色されている構造はほとんど見えないでしょうが、ピンクに染色されている構造は非常に誇張された色調を持つでしょう。.

例：赤血球は真っ赤または濃いオレンジ色になり、核クロマチンは淡いピンク色に見え、好酸球の顆粒は真っ赤になります。.

塗抹標本に沈殿物がある

原因は次のとおりです。

  • 汚れた、または洗浄が不十分なシートを使用する.
  • 塗抹標本をよく乾燥させないでください.
  • 定着液を長時間放置する.
  • 染色の終わりに不適切な洗浄.
  • 使用されている染料の不適切な濾過または不濾過.

形態的アーティファクトの存在

形態学的アーティファクトが塗抹標本に現れることがあり、存在する構造を視覚化し解釈することを困難にする。これは以下の理由によるものです。

  • ヘパリンなど、使用される抗凝固薬の種類.
  • 汚れたシート、傷んだシート、または脂っこいシートの使用.

保管モード

調製後は、染料が沈殿しないように、染料を室温（15〜25℃）に保ってください。それは閉じた琥珀色の容器に保管しなければなりません.

参考文献

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  7. 「ギムザの染み」 ウィキペディア、フリー百科事典. 2017年9月1日1時02分UTC。 2018年12月6日、ja.wikipedia.org.