グラム染色ファンデーション、材料、技術および用途



の グラム染色 診断微生物学における最も簡単で最も有用な染色技術です。この手法は、1884年にデンマークの医師Hans Christian Gramによって作成されました。彼は、細胞壁の組成に従って、グラム陽性菌とグラム陰性菌に分類しました。.

この技術は、試薬を安定化させそして染色の質を改善するために1921年にHuckerによってある種の修正を受けたので、グラム染色はグラム - ハッカーとしても知られている。.

この技術を用いて、微生物が有する形態、すなわち、とりわけ、それらが球菌、桿菌、桿菌、多形性、糸状であるかどうかを観察することも可能である。その空間内分布と同様に、クラスター内、チェーン内、孤立型、ペア内、テトラッド内など。.

細菌感染が疑われる場合は、受け取ったサンプルの大部分をスライドに広げ、顕微鏡で検査するためにグラム染色する必要があります。.

グラムの報告書は、作物の最終結果を得る前に、どの種類の微生物が感染の原因となり得るかについて医師に指導します。.

場合によっては、患者の生活が非常に危険にさらされているため、医師は微生物の同定を待っている間に経験的な治療を行うためにグラムレポートを緊急に必要とします。.

例えば、グラムが脳脊髄液にグラム陽性球菌があることを明らかにした場合、医師はそれに対して確立されたプロトコルに従って、このタイプの細菌を排除する抗生物質による初期治療を方向付けるでしょう。.

最終的な結果が単離された微生物の名前とそれぞれのアンチビオグラムとともに届くと、医師は治療法を変更するかどうかを評価します。この決定はそれが受けている抗生物質に対する微生物の感受性と患者の進化の研究に従ってなされるでしょう。.

索引

  • 1財団
  • 2材料
  • 3染料と試薬の調製
    • 3.1クリスタルバイオレット溶液
    • 3.2ヨードルゴール
    • 3.3漂白
    • 3.4コントラスト
  • 4試薬の保管
  • 5着色するサンプルの塗布の準備
    • 5.1 - 直接サンプルのグラム
    • 5.2 - 作物のグラム
  • 6テクニック
  • 7効用
  • 8よくある間違い
  • 9参考文献

財団

これは4つの基本的なステップを提示するテクニックです：染色、媒染剤との固定、変色と収縮。したがって、細菌を着色することに加えて、この技術はまた、それらを区別します.

クリスタルバイオレットは最初に使用された着色剤です。それはペプチドグリカンに対して親和性を有し、紫色は存在する全ての細菌を染色し、次いでルゴールが配置され、それは媒染剤として作用する、すなわちそれは細胞内でクリスタルバイオレット - ヨウ素 - リボ核タンパク質の不溶性複合体の形成を誘導する。.

ペプチドグリカンの厚い壁を有するグラム陽性菌は、より多くの複合体（クリスタルバイオレット - ヨウ素）を形成し、それ故にそれらは色素を保持する。.

グラム陽性菌の壁には、酸化剤に対して高い親和性を示す不飽和酸が多く含まれていることも影響します（Lugol）。.

一方、グラム陰性菌はペプチドグリカンの薄層を持っているため、グラム陽性菌よりも細菌が複雑ではありません。.

その後、グラム陽性菌とグラム陰性菌の挙動が異なる変色のステップが来ます。.

グラム陰性菌は、その細胞壁の一部であるリポ多糖類に富む外膜を含む。脂肪はアルコールアセトンとの接触により破壊されるため、外膜が不安定化し、紫色の結晶が放出されます。.

これはどのようにしてそれが色赤を取って、サフラニンまたは塩基性フクシンで対比染色されるかです。.

グラム陽性菌の場合、漂白剤が孔を塞ぐように作用し、クリスタルバイオレット／ヨウ素錯体が漏れるのを防ぐので、それらは変色に抵抗する。.

それ故、紫色の結晶による着色は安定しており、サフラニンまたはフクシンのための余地はない。このため、これらの細菌は濃い青または紫に染まります。.

材料

グラムカラーリングセットは以下から構成されています。

  • バイオレットクリスタル
  • ルゴール
  • アセトンアルコール
  • サフラニンまたはベーシックフクシン

染料および試薬の調製

クリスタルバイオレット溶液

解決策A：

バイオレットクリスタル-2 gr

エチルアルコール95％-20cc

解決策B：

シュウ酸アンモニウム-0.8 gr

蒸留水-80 cc

紫色結晶の最終調製のために、１：１０溶液を蒸留水で希釈しそして４部の溶液Ｂと混合すべきである。混合物は使用前に２４時間貯蔵する。濾紙を用いてフラスコ内で琥珀色に染色する。.

毎日使用される量は点滴器で琥珀色の瓶に転送されます.

ヨードルゴル

以下のように、指示された量の各化合物を秤量して測定する。

ヨードの結晶 - 1gr

ヨウ化カリウム - 2グラム

蒸留水-300 cc

ヨウ化カリウムは少しずつ水中に溶解し、次いでヨウ素が添加される。溶液を琥珀色の瓶に剃る。.

毎日使用される量はスポイトで小さな琥珀色の瓶に転送されます.

漂白剤

95％エチルアルコール-50ml

アセトン - 50 ml

それは等しい部分で用意されています。しっかりと覆い、蒸発しやすい.

スポイトで瓶に入れる.

この準備は5-10秒の適度な時間で変色を提供し、最もお勧めです.

初心者は変色が10から30秒までより遅いところで95％のエチルアルコールだけを使用することを好みます.

最も経験豊富な人が純粋なアセトンを使うことができる間、変色は1から5秒の間非常に速く起こります.

コントラスト

サフラニンストック溶液

サフラニナ-2.5 gr

エチルアルコール95％-100 cc

秤量後、指示された量のサフラニンが１００ｃｃのエチルアルコールに溶解して９５％になる。.

ワーキングサフラニン溶液はストック溶液から調製されます。.

これを行うには、10 ccの原液を量り、90 ccの蒸留水を加えて100 mlにします。.

それは点滴器で琥珀色の瓶に毎日使用される量を転送することをお勧めします.

特定の嫌気性菌など、グラム陰性菌でグラム陰性に弱く染色される微生物, レジオネラ属、カンピロバクター属およびブルセラ属, Gram-Kopeloff染色と呼ばれる、Kopeloffによって行われたGram-Hucker染色への修正を使用すれば、それらはずっと良く染色されることができます.

この技術はサフラニン染料を塩基性フクシンにより変化させる。この改変により、前述の微生物を効果的に着色することが可能である。.

試薬の保管

調製した染料は室温で保存する必要があります.

色に広がるサンプルの調製

サンプルには少なくとも10個含まれている必要があります5 塗抹標本中の微生物の観察前の微生物がそうです。スプレッドは直接サンプルまたは固体または液体培地中の培養物から作ることができます.

存在する構造をよりよく視覚化するために、スプレッドは均一で、よく分散され、厚すぎないようにする必要があります。.

-直接サンプルのグラム

遠心分離機なしの尿グラム

尿を混合し、そして10μlをスライド上に置く。少なくとも1つの細菌/液浸フィールドを観察すると、感染があることがわかります.

これは、培養液がおよそ100,000 CFU / ml（105 85％の症例における尿のCFU / mL）.

この方法は、100,000 CFU未満のコロニー数には役立ちません。.

LCRグラム

CSFを遠心し、上清を取り除き、ペレットをスライドに広げます。この液体は通常の条件下では無菌です。細菌の観察は感染を示します.

呼吸サンプルグラム

グラム、気管支または気管支肺胞洗浄は、さまざまな微生物が存在する可能性がありますが、観察される細胞の種類が有用であることに加えて、常に診断に役立ちます。.

痰の場合、塗抹標本はサンプルの最も化膿性の部分で調製されるべきです.

スツールグラム

診断的価値がないため、この種のサンプルに対してグラムを実行することはお勧めできません。.

-グラム作物

彼らは2つの方法で行うことができます。1つは液体作物から、もう1つは固形作物から.

液体作物

液体文化からそれは非常に簡単です。ライターの下で濁ったブロスのローストをいくつか取り、それらを清潔で乾燥したスライドの上に置き、中心から周囲に向かって円運動させて、材料を均一に分配する。.

空気中で自然に乾燥させることができます。乾燥したら、材料を熱でシートに固定する。このために、クランプの助けを借りて、材料３を燃やさないように注意しながら、シート３をブンゼンバーナーの炎に４回通す。.

シートを冷却し、着色橋の上に置く.

固形作物

固体培養物からグラム染色の延長を行うには、以下の手順に従ってください。

採取するコロニーを選択する前に、スライドを準備し、滅菌した生理食塩水を約2滴入れます。.

元の培養プレートに複数の異なる種類のコロニーが含まれている場合は、それぞれのコロニーを分離してグラムを実行します。各コロニーは、スライド上に予め配置されている食塩水にそれを溶解するためにプラチナループで撮影されます.

スライド上でコロニーを均一に分布させるために、中心から周辺への円運動が行われます。.

空気中で自然に乾燥させることができます。乾いたら、シートを熱で固定します（スライドをライターで燃やす）。材料を燃やさないように注意してください。.

この手順は、コロニーの種類ごとに実行する必要があります。一枚の紙に、観察された順番を書き留めます。例えば：

コロニー1：黄色のベータ溶血性コロニー：グラム陽性球菌が集団で観察された

コロニー２：溶血のないクリームコロニー：グラム陰性のココバクテリウムが観察された.

各シートには、何を観察しているのかを知るためのラベルを付ける必要があります.

テクニック

グラム染色法は実施が極めて簡単で比較的安価であり、微生物学実験室では見逃せない。.

次のように同じことが行われます。

  1. 塗抹標本を熱で固定し、色付きの橋の上に置く.
  2. シートを紫色のガラスで１分間完全に覆う。.
  3. 水で洗います。乾かさないで
  4. プレートをLugol溶液で覆い、1分間放置する。水で洗います。乾かさないで.
  5. アセトンアルコール中で穏やかに撹拌しながら５〜１０秒間混合する。または、シートを直立させて置き、残りのすみれ色のガラスが引き離されるまで脱色剤の液滴を表面に滴下します。超えないでください.
  6. 水で洗います。乾かさないで.
  7. 色のついた橋の上にシートを置き、サフラニン（グラム - ハッカー）で30秒間または塩基性フクシン（グラム - コペロフ）で1分間カバーする。.
  8. 水で洗う
  9. 垂直空気中で自然乾燥させる.

乾燥したら、光学顕微鏡で100倍の対物レンズの下にそれを観察するために液浸油を1滴置きます.

効用

この技術は、ほとんどの細菌の形態型の違いを区別することができます.

酵母もこの色によって区別されます。彼らはクリスタルバイオレットを取ります、すなわち、彼らはグラム陽性染色します.

一方、グラム陽性胞子形成桿菌は区別することができ、そこでは、胞子はよく染色されないが、内生胞子が形成された桿菌の内部に明確な空間が観察される。胞子を使用するには、Shaeffer-Fultonなどの他の手法が使用されます。.

この染色はすべてのタイプのバクテリアを着色するのに役立つわけではないことに注意すべきです、すなわち、染色がうまくいかないケースがあります.

この場合、細胞壁を欠く細菌が言及され得る。例えば、マイコプラズマ属、スフェロプラスト、ウレアプラズマ、L型およびプロトプラスト.

また、マイコバクテリアなどのミコール酸が豊富な壁とクラミジアやリケッチアなどの細胞内バクテリアでひどくバクテリアを染色します。.

ほとんどのスピロヘータ細菌を染色することも非効率的です.

グラム陽性およびグラム陰性と同じサンプルで観察することができる同じ属の細菌があります。これが起こるとき、それは栄養素、温度、pHまたは電解質の濃度の変化に起因するかもしれない可変グラム染色と呼ばれます。.

よくある間違い

過度に漂白する

変色段階を誇張することは偽グラム陰性微生物の観察を引き起こす可能性がある.

液浸油を追加するのに十分な乾燥時間を待ちません：

この誤りは、存在する構造を観察することを困難にする脂肪ミセルの形成を引き起こす。これは、塗抹標本に含まれる水分子が油に結合したときに起こります。.

試薬の順序を逆にする：

このようなエラーは、グラム陰性菌に紫色を表示させます。つまり、偽のグラム陽性菌です。.

古い農作物（固体または液体）を使う：

それはグラム陽性菌にグラム陰性（偽グラム陰性）を染色させる可能性があります。これは、古い文化では死んだあるいは劣化したバクテリアがあり、これらの条件下でバクテリアがバイオレットクリスタルを保持していない可能性があるために起こります。.

非常に古いLugolソリューションを使用してください。

時間が経つにつれて、lugolはその特性を失い、その色は消えます。既に縮退した試薬を使用するとクリスタルバイオレットをうまく固定できないため、誤ってグラム陰性の微生物を可視化する可能性があります。.

青みがかった背景

正しく変色した背景は赤になります。青い背景は、変色が不十分だったことを示します.

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